紡織染料血細胞染色技術
紡織染料可染血細胞和骨髓中血細胞，有的可替代細胞化學染色，也有的可區分TH(CD4)細胞和TC/ TS細胞(CD)細胞。近年Kass又進行了禽類血細胞染色，并取得了滿意結果，已引起國內檢驗界的高度重視。自從“紡織染料在血細胞形態學檢驗中的應用”一文在《中華檢驗醫學雜志》發表后，陸續收到各地讀者來信或電話，詢問有關紡織染色有關技術問題，為了促使這一技術盡快在國內推廣，同時為國產紡織染料擴大應用范圍，現就國內外利用紡織染料染色血細胞技術問題綜述如下。
1 標本制備
1. 1 紡織染料血細胞染色：所用的標本可采用末梢血涂片、骨髓涂片和外周靜脈抗凝血濃集涂片等。
1. 2 靜脈抗凝血濃集涂片：通常抽取患者外周靜脈血于含有乙二胺四乙酸的抗凝管中，在室溫靜置2h，使紅細胞自然沉降。用移液管從抗凝管中提取富含白細胞的血漿于離心管中，以2 500 r/ min離心5 min，移去上清液，剩下0. 1 mL富含白細胞和血小板濃集液。用濃集細胞制成濃集涂片，晾干。
2 固定液
固定是血細胞染色的重要步驟，紡織染料染色所用的固定液與傳統的細胞化學染色方法所用固定液基本相同。Kass常用的有Bouin固定液(苦味酸飽和液75 mL，冰乙酸5 mL，37 %甲醛20 mL)、FAA固定液(這是紡織染料血細胞染色常用的固定液，由95 %乙醇90 mL，37 %甲醛5 mL和冰乙酸5mL配制而成，嚴格密封于室溫下保存1年)、甲醇。另外，國內外有的將紡織染料的甲醇液或乙醇液直接加在涂片上，使固定和染色同步進行。
3 紡織染料
3. 1 國外紡織染料：堿性藍122，C. I. basic blue122，basacryl blue X4GFL(BASF，Whippany，NJ)；堿性藍141，C. I. basic blue 141，basacryl blueX7GFL(BASF，Whippany，NJ)；堿性藍148，C. I.basic blue 148，Remacryl blue 4RL(Hoechst，Frankf urt)；堿性藍54，C. I. basic blue 54，basacrylblue GF(BASF，Charlot te，NC)；堿性藍41，C. I.basic blue 41，Remacryl blue BRL(Hoechst，Charlot te，NC)；堿性藍75，C. I. basic blue 75，Ast razon blue 9GL(BASF，Charlot te，NC)；酸性紅52，acid red 52(Int racide rhodamine B Cromptonand Kndwles，Charlot te，NC)；酸性紅360，acid red360(Telon Fast Red AFG，Mobay Chemical Co，Pit t sburgh，PA)；酸性紅137；Synacril黑；堿性藍93。
3. 2 國內紡織染料：堿性品藍Basic royol blue天津染化四廠；直接耐曬黑GBenzo fast black G河南安陽染料廠；堿性藍Basic blue天津化工采購供應站；活性艷藍KNR；活性艷藍XBR；活性艷橙K27R；活性紅棕KB3R；分散紅3B；酸性棗紅；酸性大紅；還原桃紅；活性艷紫X-2R；直接綠BE；士林綠FFB；硫化青BR；堿性橙；酸性橙。
4 染色液
顯色是血細胞染色的關鍵步驟，染色結果的成敗與染色液緊密相關。
4. 1 紡織染料水溶液：Kass所用可溶于水的紡織染料有堿性藍141、堿性藍93、堿性藍54、堿性藍148、酸性紅52、酸性紅137、Synacril黑等。將這些紡織染料配制成一定濃度的水溶液，室溫下至少穩定1年。①堿性藍54水溶液，300 mg染料溶于10mL蒸餾水中。②1 %堿性藍141水溶液，置于有蓋塑料瓶中。③2. 5 %堿性藍141水溶液，經2 000 r/min離心10 min，取上清置于磨口瓶中。④10 %堿性藍141水溶液。⑤堿性藍148水溶液，5 g堿性藍148染料溶于100 mL去離子水中。置于有蓋玻璃瓶中。⑥1 %酸性紅52水溶液，置于有蓋塑料瓶中。⑦10 g/ L堿性品藍水溶液，朱蕓等用堿性品藍的水溶液進行染色。
4. 2 紡織染料緩沖溶液：Kass還將紡織染料堿性藍75、堿性藍141配成紡織染料堿性緩沖液，將堿性藍41配成磷酸鹽緩沖液，郝冀洪等將堿性品藍配成N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(N-2-hydroxyet hylpiterazine-N’-2-ethanesulfonic acid，HEPES)溶液。
4. 2. 1 堿性藍75堿性緩沖液：首先將400 mg堿性藍75染料溶于7 mL蒸餾水中，攪動使染料溶解，然后加入p H 7. 6的Trizma maleat緩沖液4 mL，攪動10 s，在臨用前配制成工作液，室溫可穩定24 h。染液配制的順序非常關鍵，否則影響染色結果。
4. 2. 2 堿性藍141堿性緩沖液：10 %堿性藍141水溶液加入等量p H 7. 6的Trizma maleat緩沖液中，使用前配制，室溫可穩定2 h。
4. 2. 3 p H 7. 6的Trizma maleat緩沖液：將Trizmamaleat 47. 44 g置于圓形量筒內，加950 mL蒸餾水，然后置一大燒杯中，滴加濃NaOH并不斷攪動使p H為7. 6，最后加蒸餾水至1 L。
4. 2. 4 1 %堿性藍41磷酸鹽緩沖液染液：1 g堿性藍41染料溶于p H 6. 8磷酸鹽緩沖液中(Na2 HPO4•7 H2O 8. 9 g和KH2 PO4 4. 6 g溶于1 L蒸餾水中，調p H至6. 8)。
4. 2. 5 1 g / L堿性品藍HEPES染液：首先配制1g/ L HEPES p H 7. 0溶液，再將堿性品藍溶于HEPES溶液中，配成堿性品藍HEPES染液。
4. 3 紡織染料甲醇溶液：Kass將紡織染料堿性藍41、堿性藍54、堿性藍122、堿性藍141、酸性紅360等直接溶于甲醇中，配成一定濃度的紡織染料甲醇染液，室溫可穩定1年。
堿性藍54甲醇染液。堿性藍122甲醇染液，10 %堿性藍122甲醇溶液。堿性藍141甲醇染液，5 %的堿性藍141甲醇溶液經2 000 r/ min離心10min，取上清置于磨口瓶中。1 %堿性藍360甲醇染液。堿性藍甲醇染液，王彩云等將國產紡織染料堿性藍直接溶于甲醇中。
4. 4 紡織染料乙醇溶液：①1 g/ L耐曬黑G乙醇染液，李順義等將國產紡織染料耐曬黑G直接溶于乙醇中，配成1 g/ L耐曬黑G乙醇染液，室溫可穩定1年。②10 g/ L堿性品藍乙醇染液，郝冀洪等將國產紡織染料堿性品藍直接溶于乙醇中，配成10g/ L堿性品藍乙醇染液，4℃可穩定1年。
4. 5 紡織染料的混合染液：Kass將1 %堿性藍41磷酸鹽緩沖液染液5 mL、1 %堿性藍141水溶液5mL和1 %酸性紅52水溶液5 mL配成混合染液。
5 漂洗液
漂洗是紡織染料染色的特殊步驟，也是與傳統的血細胞染色方法主要的區別之處。Kass所用漂洗液主要有以下幾種，甘氨酸-NaCl-NaOH p H8. 45緩沖液。Ⅰ液，將NaCl 5. 856 g溶于50 mL蒸餾水中，加入甘氨酸7. 507 g溶解后加蒸餾水至1L。Ⅱ液，將NaOH 4 g溶于50 mL蒸餾水中，移入1 L容量瓶，加蒸餾水至1 L。?、褚?5 mL加入Ⅱ液5 mL并調至p H 8. 45。加幾滴石炭酸防腐，可在5℃冰箱保存數月。
醋酸鈉緩沖液(p H 3. 4)。將醋酸鈉27. 22 g溶于400 mL蒸餾水中，加冰醋酸并不停攪動，使p H至3. 45，移入1 L容量瓶，加蒸餾水至1 L。
磷酸鹽緩沖液(p H 5. 6)。Ⅰ液，Na2 HPO49. 465 g溶于500 mL蒸餾水中，移入1 L容量瓶，加蒸餾水至1 L。Ⅱ液，KH2 PO4 9. 07 g溶于500mL蒸餾水中，移入1 L容量瓶，加蒸餾水至1 L。于Ⅱ液95 mL中加入Ⅰ液5 mL，5℃穩定6個月。
醋酸鈉-醋酸緩沖液(p H 3. 6)。Ⅰ液，0. 1 mol/L冰醋酸溶液。在1 L容量瓶中加冰醋酸5. 7 mL，加蒸餾水至1 L。Ⅱ液，0. 1 mol/ L醋酸鈉溶液。將醋酸鈉13. 6 g溶解后移入1 L容量瓶，加蒸餾水至1 L。Ⅰ液185 mL加Ⅱ液15 mL充分混勻。
HEPES多離子緩沖液(p H 7. 0)。溶解下列成分于1 L蒸餾水中作為100 %濃縮液。乙酸鎘3. 6mg、氯化錳2. 3 mg、乙酸鉀251 mg、三氯化鐵500mg、氯化鈣33 g、氯化鈉17. 8 g、HEPES 11. 9 g。1L濃縮液加10滴液體石炭酸作防腐劑，5℃可穩定1年。實驗中用1∶100蒸餾水稀釋后進行漂洗。
國內建立的紡織染料血細胞染色法均無漂洗過程。
6 染色方法
6. 1 單染
6. 1. 1 以固定液固定后的涂片直接加紡織染料水溶液染色
6. 1. 1. 1 粒細胞染色法：FAA固定涂片5 min，堿性藍93染色的水溶液染色。
6. 1. 1. 2 粒細胞染色法：Bouin固定液固定涂片5min后，用酸性紅52水溶液染色。
6. 1. 1. 3 單核細胞染色法：FAA固定涂片5 min，用蒸餾水漂洗10 s，晾干，堿性藍54水溶液染色10min，倒去多余的染液，在醋酸鈉-醋酸緩沖液p H3. 6中漂洗2 s，晾干。
6. 1. 1. 4 TH細胞染色法：FAA固定涂片5 min，用蒸餾水漂洗15 s，晾干，堿性藍148水溶液染色1min，磷酸鹽緩沖液p H 5. 6中漂洗2 s，晾干。染液染色3 min，用于離心的細胞群。
6. 1. 1. 5 巨核細胞質/組織嗜堿細胞顆粒/嗜酸粒細胞顆粒染色法：甲醇固定涂片5 min，Synacril黑AN水溶液染色10 min。
6. 1. 1. 6 全血細胞染色法：甲醇固定涂片2 min，水洗，堿性品藍的水溶液染色10 min，水洗，干后鏡檢。
6. 1. 2 以固定液固定后的涂片加紡織染料堿性水溶液染色：幼稚紅細胞染色法，FAA固定涂片5min，用蒸餾水漂洗15 s，晾干，用堿性藍75堿性緩沖液染色10 min，倒去染液，在甘氨酸-NaCl-NaOHp H 8. 45緩沖液中漂洗2 s，晾干。中性粒細胞染色法，FAA固定涂片5 min，堿性藍141堿性緩沖液染色。
6. 1. 3 紡織染料乙醇溶液直接染色：粒細胞染色法，涂片置培養皿中，加1 %耐曬黑G乙醇溶液加蓋，置37℃水浴箱15 min，水洗數次，蒸餾水洗3次，待干，以中性紅液復染30 s，水洗。
6. 1. 4 紡織染料甲醇溶液固定并染色：嗜堿粒細胞/嗜酸粒細胞顆粒染色法，堿性藍41甲醇溶液固定并染色。組織嗜堿細胞/嗜堿細胞染色法，堿性藍甲醇溶液染色15 min，水洗。
6. 2 雙染
6. 2. 1 TH細胞(輔助性T淋巴細胞)和TC/ TS細胞鑒別染色法：堿性藍141甲醇染液1mL染色5min后加堿性藍141堿性緩沖溶液1 mL染色10min，倒去多余的染液，在HEPES p H 7. 0多離子緩沖液中漂洗10～15 s。
6. 2. 2 單核細胞染色法：堿性藍54甲醇液染色5min后，加堿性藍141堿性緩沖液染色10 min，磷酸鹽緩沖液p H 5. 6漂洗5 s。
6. 2. 3 嗜酸粒細胞染色法：堿性藍122甲醇液染色5 min后，加堿性藍141堿性水溶液，使兩種溶液充分混合，10 min后，醋酸鈉緩沖液p H 3. 4漂洗5s。
6. 2. 4 巨核細胞染色法：堿性品藍乙醇染液0. 5mL，染色5 min后再滴加等量堿性品藍HEPES染液，充分混勻染色10 min。流水沖洗2 min，晾干。
6. 2. 5 禽類白細胞染色法：酸性紅360甲醇液染色1 min，1 %堿性藍41磷酸鹽緩沖液p H 6. 8染液、1 %堿性藍141水溶液和1 %酸性紅52水溶液各5mL配成混合染液中染色5 min，磷酸鹽緩沖液p H5. 6漂洗10 s。
近年來，血液學檢驗技術的飛速發展及血液分析儀在全國各級醫院的普及使用，大大提高了臨床血液學檢驗的質量和效率，使臨床血液學檢驗進入了一個新的階段。血涂片形態學檢驗作為臨床檢驗學的一項簡便、快捷的診斷方法，在血液病及血液感染性疾病的檢驗中起著重要的作用。紡織染料染色方法簡單，染料便宜，染色結果穩定特異，不需特殊的儀器設備，易于在各級醫療單位推廣應用。我國是紡織大國，國產紡織染料眾多，有些國產紡織染料有一定特色，利用國產紡織染料進行血細胞染色，既拓寬了國產紡織染料的應用范圍，也可摸索出一些新的染色方法，具有良好的社會效益和經濟效益，發展前景廣闊。
